荧光蛋白基因论文（精选10篇）
荧光蛋白基因论文 第1篇
本文采用基因重组技术将黄绿荧光蛋白基因重组到穿梭质粒表达载体上,构建了含黄绿荧光蛋白基因的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体,为生防枯草芽孢杆菌基因标记以及菌株定殖的研究提供必备的实验材料。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒
本研究所用菌株与质粒见表1。
1.1.2 培养基与培养条件
大肠杆菌用LB培养基(蛋白胨10g,氯化钠10g,酵母抽提物5g,水1000mL,pH7.0,121℃灭菌20min。),37℃培养震荡培养18h。
1.1.3 试剂
限制性内切酶,T4DNA连接酶,DNA回收试剂盒,化学试剂:自大连宝生物工程公司。
1.1.4 抗生素与溶液
氨苄青霉素(Amp),工作浓度50μg/m L;氯霉素(Cm),工作浓度10μg/m L。
溶液Ⅰ:50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris.HCl(pH8.0),10mmol/L EDTA(pH8.0);
溶液Ⅱ:0.2mmol/L Na OH,1%SDS;
溶液Ⅲ:5mmol/L乙酸钾60mL,冰乙酸11.5mL,双蒸水28.5mL;
TE:10mmol/L Tris.HCl(pH8.0),1mmol/L EDTA(pH8.0);
RNase溶液:10mg RNase溶于1mL 10mmol/L Tris.HCl(p H7.5),15mmol/L Na Cl中,于100℃加热15min,冷却后保存于-20℃。
1.1.5 仪器
台式高速离心机LG15-W,北京医用离心机厂;电热恒温水浴锅HWS24,上海一恒科技有限公司;电热恒温培养箱WMK-02,南京电器厂;紫外分光光度计LINDA,日本岛津公司;电子分析天平AEL-160,日本岛津公司;凝胶成像系统UVP,英国Cambridge紫外仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 质粒提取
采用碱裂解法[6]从大肠杆菌中提取pEYFP和pH-PS9质粒DNA。
活化含pEYFP和pHPS9质粒DNA的大肠杆菌,用-70℃保存的菌液划线接种于LB加相应抗生素固体平板上,37℃过夜培养;取单菌落转接于5mL LB+Cm(p HPS9)和5mL LB+Amp(pEYFP)液体培养基中,37℃过夜培养;按1%接种量再分别转接于50mL LB加相应抗生素的液体培养基中,37℃过夜培养。次日取50mL菌液,在4℃,4000r/min转数下,离心10min,弃去上清液,用2mL含10mg Lysozyme的溶液Ⅰ溶解菌体,室温放置5min,加入4mL溶液Ⅱ,温和倒置数次使其混合均匀,置于冰上10min,再加入3mL溶液Ⅲ,快速倒置数次于冰上10min,以13000r/min转数离心30min,向上清液中加入0.6倍体积异丙醇,室温放置15min,在12000r/min转速数下离心30min,加入0.5mL TE溶解沉淀,再加入RNA酶10μL,放入37℃水浴中反应1h,加入等体积酚、酚-氯仿、氯仿抽提,用100%乙醇沉淀质粒DNA,用70%冰冷的乙醇洗1次,沉淀干燥后,溶于50μL TE中,置于-20℃冰柜中备用。
1.2.2 双酶切反应[7]
先用Bam HI酶切pEYFP和pHPS9质粒DNA,10μL反应体积中含1～2μg pEYFP或pHPS9质粒DNA,1μL 10×B buffer,1～2U Bam HI,加入ddH2O补足体积。将反应管放于30℃水浴中2h后,置于70℃水浴10min,终止酶反应。再用EcoRI酶切,在上述反应液中加入1～2U EcoRI,1μL 10×H buffer,加入ddH2O补足体积至20μL,将反应管放于37℃水浴中2h后,置于70℃水浴10min,终止酶反应。用酚-氯仿抽提酶切后的pHPS9质粒DNA,乙醇沉淀,用ddH2O溶解沉淀。酶切后的pEYFP进行1%琼脂糖电泳,回收约714bp的EYFP DNA片段。DNA片段回收采用试剂盒。
1.2.3 连接反应
10μL反应体积中含有1μL 10倍连接缓冲液,2U T4DNA连接酶,适当浓度比的EYFP DNA片段与pHPS9质粒DNA,置于22℃水浴中连接4～6h,终止连接反应。
1.2.4 感受态细胞制作与转化
从平板上挑取E.coli.DH5α单菌落接种于5mLLB培养液中,37℃过夜培养,次日按1%接种量转接于50mLLB培养液中,在37℃水浴摇床中快速震荡培养至OD550=0.5。将培养液置于冰浴中10min之后,在4℃,5000r/min转速下离心5min,收集菌体,将菌体重新悬浮于25mL冰冷的50mmol/L Ca Cl2,10mmol/L Tris.HCl溶液中,冰浴中至少放置20min,在4℃,5000r/min转速下离心5min,将菌体再悬浮于2mL冰冷的50mmol/LCaCl2,10%甘油中,分成100μL体积一份,于4℃放置过夜后,立即放入-70℃冰箱中保存备用。
取100μL冷冻的感受态细胞放入冰浴中融化,加入20μL 50mmol/LCa Cl2,10mmol/L Tris.HCl溶液,再加入40～50ngDNA,混匀后,于冰浴中放置30min,立即放入42℃水浴中热刺激2min,取出后加入100μL LB培养液于37℃水浴中放置1h。取100μL培养液涂布于加有IPTG和X-Gal的LB平板上,然后将LB平板放置于37℃温箱中过夜培养。
1.2.5 阳性重组子筛选与鉴定
随机挑选单菌落,用煮沸法快提质粒DNA,先用1%琼脂糖凝胶电泳初筛DNA分子量大于质粒载体(pHPS9)的重组子DNA,再用EcoRⅠ/Bam HⅠ双酶切方法进一步验证重组子。
2 结果与讨论
2.1 质粒DNA浓度与纯度
用LB培养液过夜培养,取50mL菌液离心收集菌体,按方法所述提取质粒DNA,用紫外吸收法测定DNA纯度,琼脂糖电泳法测定DNA分子量大小。50mL菌液可以获得30μg pEYFP DNA和26μg pH-PS9 DNA,经测定,其OD260∶OD280=1.76,琼脂糖凝胶电泳表明DNA分子量与理论值相符。结果见图2。
2.2 表达载体的构建
按照图1构建表达载体。将EYFP基因连接到穿梭质粒表达载体pHPS9多克隆位点区。
2.3 阳性重组子筛选与鉴定
10μL连接液转化100μL感受态细胞,涂2个LB+Cm平板,37℃培养18h。每个平板上均有200多个转化子,随机挑取10个转化子,提取质粒DNA,并用EcoRⅠ/Bam HⅠ双酶切下与EYFP基因大小一致的DNA片段,证明该转化子为阳性重组子。结果见图2、3、4。
1:质粒p EYFP DNA;2:质粒p EYFP DNAEcoRⅠ/BamHⅠ双酶切M:λDNA/HindⅢMarker(23130、9461、6556、4361、2322、2027、564)
1-5:质粒p HPS9-EYFP DNAM:λDNA/HindⅢMarker
1:质粒pEYFP EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切2:质粒pHPS9-EYFP EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切
3 结论
利用DNA重组技术,成功地将黄绿荧光蛋白基因(EYFP)重组到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体pHPS9上,获得了含EYFP基因的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体pHPS9-EYFP,从而为生防菌株的基因标记提供了必要的材料。
摘要：质粒pHPS9为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体,本项研究采用基因重组技术将黄绿荧光蛋白基因EYFP重组到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体pHPS9上,转化到感受态大肠杆菌中,获得含有pHPS9-EYFP质粒的阳性重组子。经双酶切和琼脂糖凝胶电泳验证,成功构建了能在枯草芽孢杆菌中表达的含有EYFP基因的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体,为生防菌株的基因标记提供了必要的材料。
关键词：黄绿荧光蛋白基因(EYFP),穿梭质粒,表达载体构建
参考文献
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[5]张淑梅,王玉霞,李晶.基因标记枯草芽孢杆菌BS-68A在黄瓜上定殖[J].生物技术,2006,16(4):73～74.
[6]都艳霞,沙伟,张梅娟.碱裂解法提取重组质粒DNA及PCR验证[J].生物技术,2009,19(2)35～37.
荧光蛋白基因论文 第2篇
含RGD肽基因导入系统介导绿色荧光蛋白基因转染骨髓基质干细胞的瞬时表达检测
目的评价以整合素为靶向的新型非病毒载体系统--含RGD肽基因导入系统K16GRGDSPC(记作K16-RGD)作为基因转染载体的`可行性.方法固相合成法合成K16-RGD,以其为载体与不同比例的增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)混合转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),72 h后用荧光显微镜观察转染效率及瞬时表达情况.结果转染效率与K16-RGD和质粒的比例有关,转染体系中K16-RGD(μg):pEGFP(μg)为3:1时EGFP有最高的表达效率.结论含RGD肽K16-RGD能有效介导外源基因在BMSCs内的转染和表达,为下一步利用K16-RGD作为载体构建载基因仿生基质材料进行骨缺损修复研究奠定了基础.
作 者： 潘海涛 郑启新 郭晓东 刘勇 宋玉林 作者单位： 430022,华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科 刊 名： 国际生物医学工程杂志 ISTIC PKU 英文刊名： INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOMEDICAL ENGINEERING 年，卷(期)： 2006 29(3) 分类号： Q78 Q813.1 关键词： 含RGD肽 绿色荧光蛋白基因 基因转染 骨髓基质干细胞
绿色荧光蛋白的发现与发展 第3篇
2008年的诺贝尔化学奖授予了从事有关“绿色荧光蛋白质的发现，表达和发展”并取得重要成就的三位科学家：下村修、马丁·查尔菲和钱永健。
绿色荧光蛋白及其发光机理
绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein，简称GFP)是一种在美国西北海岸所盛产的水母中所发现的一种蛋白质。这类学名为Aequorea victoria的水母有着美丽的外表，生存历史超过1.6亿年。1962年，下村修正是在这种水母的发光器官内发现天然绿色荧光蛋白。它之所以能够发光，是因在其包含238个氨基酸的序列中，第65至67个氨基酸(丝氨酸—酪氨酸—甘氨酸)残基，可自发地形成一种荧光发色团。
当蛋白质链折叠时，这段被深埋在蛋白质内部的氨基酸片段，得以“亲密接触”，导致经环化形成咪唑酮，并发生脱水反应。但此时还不能发射荧光，只有当有分子氧存在的条件下，发生氧化脱氢，方能导致绿色荧光蛋白发色团的“成熟”，形成可发射荧光的形式。上述绿色荧光蛋白发色团的形成过程，系由几位科学家分别研究完成的。
绿色荧光蛋白不仅无毒，而且不需要借助其他辅酶，自身就能发光，可以让科学家在分子水平上研究活细胞的动态过程。当绿色荧光蛋白的基因和我们感兴趣的有机体内所拟研究的蛋白质基因相融合时，蛋白质既能保持其原有的活性，绿色荧光蛋白的发光能力也不受影响。通过显微镜观察这种发光的“标签”，科学家就能做到对蛋白质的位置、运动、活性以及相互作用等一目了然。在一个活体中有数万种不同的蛋白质，这些蛋白质精细地控制着重要的化学进程。如果蛋白机制发生故障，通常就会t发生疾病。绿色荧光蛋白可帮助研究这类机制，这就是为什么绿色荧光蛋白成为生物科学极其重要的工具。在它的帮助下，科学家还能对各种细胞的命运了如指掌，比如，脑神经细胞是如何发育起来的，或者癌症细胞是如何扩散的……
今天，已经有了许多新的不同的绿色荧光蛋白变体，这就进一步完善了绿色荧光蛋白作为基因标志在生物研究中的广泛应用。
下村修与绿色荧光蛋白的发现
Aequorea victoria水母是一种生物发光体。1960年，下村修为搞清它的生物发光机制，参加了普林斯顿大学弗兰克·约翰逊实验室的工作。Aequorea victoria生物发光的活性组分曾被认为是一种与钙离子相关联的蛋白质，被称为水母素(水母素现在仍是一种检测生物体内钙离子的方法之一)。但在此形式下，所发射的是蓝光。对此，下村修曾做了大量的工作来说明所发射的荧光究竟是绿光还是蓝光。研究人员分离了大量的蛋白质，都显示出强烈的绿光，于是他在1962年写道：“由蛋白质所得的溶液在日光下是稍稍发绿的，但在钨灯下则为黄色，在紫外光下则呈现出很亮的、绿色的荧光”。应当说，对这一问题的认识是在不断提高的。他们在无直接试验证据的情况下，提出了绿色荧光蛋白所发的绿光是因受钙激发而发光的水母素，其能量向绿色荧光蛋白发生了转移所致。按现代的科学术语来说，水母素是作为一种能量给体，而绿色荧光蛋白则成为能量受体。这一观点，后来得到了实验的证实。但应当指出的是两种色素是独立存在的，并无依赖关系。
虽然绿色荧光蛋白最初只是水母素研究中的一项偶然发现的“副产品”，但总的说来，下村修在发现绿色荧光蛋白的过程中作出了重要的贡献。如对其纯化和物理化学表征等方面，以及在不同条件下的激发光谱和发射光谱的测定等，绿色荧光蛋白与水母素两者间的能量转移，并解释了由绿色荧光蛋白发射的是绿光而不是蓝光。如果没有这些经典性开创工作，有关绿色荧光蛋白的出现和广泛应用将推迟几十年，甚至至今它仍作为一种秘密保留在太平洋中。
查尔菲把绿色荧光蛋白用于有机体
1985年，道格拉斯·普瑞舍克隆了水母素的基因。1992年，他又克隆出完整的由238个氨基酸编码的绿色荧光蛋白基因。可惜的是，普瑞舍没有进一步尝试把该基因引入其他生物体内，虽然他在1992年的有关克隆工作的总结中最后指出：“迄今尚无可用的发色团生物合成的有关信息，而这种蛋白质的重组方式可以成为一种有价值的试剂，使我们可在这类特殊的蛋白质内，来试验发色团生成的生物化学，以及在水母素和绿色荧光蛋白间的能量转移机制等”。将绿色荧光蛋白表达到其他有选择的有机体这项工作，具有重大的生物学意义。这就涉及马丁·查尔菲的工作了。
马丁·查尔菲所从事的研究是有关小线虫神经细胞的发展。当查尔菲第一次听说到绿色荧光蛋白时，他十分激动地从利用分子遗传学方法来研究线虫问题，转移到将绿色荧光蛋白与有机体中蛋白质基因相融合的工作，并先后在两种小线虫中得到表达，即绿色荧光蛋白在不同的有机体中显示出亮绿色的荧光，因此确认了绿色荧光蛋白可作为一种通用的基因标志，而应用于各种有机体中。接着，他还得到了绿色荧光蛋白在有机体内的不同部位和不同时间发展下的表达结果。1994年2月初查尔菲及其合作者把这些研究结果发表在《科学》杂志上，并引起轰动。
绿色荧光蛋白的荧光形式不仅可用以表达小线虫、果蝇等，对哺乳动物的细胞也适用，从而使定量研究活细胞的动态过程成为可能。查尔菲等人的工作向人们展示出，绿色荧光蛋白作为一种通用的基因标志，在生物研究中有着无限的潜力。
钱永健的贡献
钱永健和他的同事不仅加深了对绿色荧光蛋白发光机制的了解，比如分子氧的作用，由此可以解释为什么绿色荧光蛋白在有机体内可容易地发射荧光。更重要的是发现了一些新的具有不同光谱行为的绿色荧光蛋白变体，从紫外部分一直位移到蓝色。这些结果表明，绿色荧光蛋白在进行取代或进行化学转换上是十分活泼的，而这些改进了的绿色荧光蛋白，为其在生物科学中的成功应用铺设了一条康庄大道。
钱永健及其合作者，还解决了绿色荧光蛋白的晶体结构问题，从而允许能够较合理地对具不同性质的变体合成进行设计。这些新变体有的荧光更强，有的呈黄色，有的呈蓝色，有的呈红色，有的可激活、可变色。这意味着除绿色以外，还可以用其他颜色荧光蛋白标示不同的蛋白质和细胞。今天，绿色荧光蛋白及其变体作为基因标志，已实现了工具化，有了通用的“工具盒”，可应用于所有生命体系中的科学研究。
在此笔者还想谈一点感想。虽然这一获奖项目为化学奖，但是它所涉及的大量工作都和生物和生命科学相关，包括所研究对象，以及它的实际应用等。这说明现代科学的分类已不拘泥于以往的格局。这还使我联想到目前我们化学家对于物理和生物科学的生疏，以及物理学家见到苯环结构而害怕的情况。这些现状表明，我们的大学教育确是有进一步改革的必要。
荧光蛋白基因论文 第4篇
关键词：绿色荧光蛋白(GFP)转基因鼠,肝细胞,荧光原位杂交,Y染色体,造血重建
荧光鼠是绿色荧光蛋白(GFP)转基因鼠,全身所有细胞都带荧光。用荧光雄鼠的细胞移植治疗雌鼠后,如果移植的细胞存活,可以通过两个途径来证明。一是检测外周血和各脏器中GFP阳性细胞的百分比,一是检测骨髓细胞中Y染色体阳性细胞的百分比。在这个实验中,用成年荧光雄鼠的肝细胞回输给半致死量射线照射的雌鼠,来研究成年鼠的肝细胞悬液是否能重建造血功能。
已报道胎儿肝脏含有造血干细胞,而成年荧光鼠的肝脏细胞中是否含有造血干细胞,目前还不清楚。还有文献报道肌肉细胞能重建小鼠造血功能[1],而成年鼠肝细胞是否能重建小鼠造血功能需要深入的研究。
据文献报道,肝细胞移植有潜能处理急性和慢性肝衰竭和代谢缺陷,对肝衰竭等待肝移植的患者是一种替代治疗方法[2,3,4]。肝细胞移植一般通过注射到脾髓、脾动脉、脾静脉或门静脉[5,6]。而本研究通过尾静脉将肝细胞移植给雌鼠,来观察肝细胞在雌鼠体内的存活和分布,对肝细胞移植治疗有一定的指导意义。
1 材料与方法
1.1 实验动物
SPF级GFP转基因雄鼠3只,体质量22~25 g,由昆明大学王廷华教授惠赠。SPF级C57BL雌鼠10只,体质量22~25 g,购自第三军医大学实验动物中心[SCXK(渝)2005-0007],饲养于解放军昆明总医院实验动物中心[SCXK(滇)2005-0008],体质量22~25 g,无菌手术在解放军昆明总医院实验动物科学部屏障动物实验设施中进行[SYXK(滇)2008-0005],并按实验动物使用的3R原则给予人道关怀。
1.2 红细胞裂解液配制
NH4Cl 8 g,NaHCO30.84 g,Na2EDTA 0.37 g,加蒸馏水到1 000 m L。
1.3 C57BL雌鼠照射
C57BL雌鼠共10只,用直线加速器照射,剂量600 Gy,剂量率50 Gy/min,原皮距98.5 cm,距雌鼠中部100 cm。7只回输肝细胞,3只回输生理盐水。
1.4 荧光鼠肝细胞悬液制备
荧光鼠处死后,无菌取肝,用双抗浸泡,置于100目筛网上,用注射器针蕊压碎,收集滤过的细胞,用氯化铵溶血1次,计数,离心,取5×106个肝细胞,悬于0.5 m L盐水,通过尾静脉输注照射。
1.5 外周血GFP阳性细胞百分比检测
剪鼠尾,取血滴入预先装有100μL抗凝剂的EP管中,混匀,离心吸掉抗凝剂,用氯化铵溶液裂解红细胞,上流式细胞仪检测GFP阳性细胞百分比。
1.6 外周血中GFP与CD4-PE或CD8-PE双阳性细胞检测
剪鼠尾取血100μL,分两管,每管50μL,一管加入CD4-PE(购自Biolegend)1.5μL,一管加入CD8-PE(购自Biolegend)1.5μL,室温30 min,用氯化铵溶血,上流式细胞仪检测。
1.7 荧光原位杂交检测Y染色体
1.7.1 染色体玻片标本的处理
滴片后,在相差镜下检查染色体的分散情况,选择染色体分散良好,细胞质少的玻片标本做FISH。65℃烤箱中烤片2~3 h后,取出放室温下备用。或者放在室温下过夜,第2天用。
1.7.2 探针的配制和变性
取10μL biotin-16-dU TP标记好的小鼠Y染色体特异探针(一次杂交用),置于EP管中。将EP管置于70℃水浴中10 min,使探针变性,然后在37℃水浴中退火30~60 min或者用PCR仪进行探针变性。
1.7.3 染色体玻片标本的变性
将70%甲酰胺置于水浴中加热至65~67℃。将备用的染色体玻片标本放入预热好的65~67℃、70%甲酰胺中变性1.5~2.0 min,立即将玻片标本取出,放入冰冷的70%乙醇中,1 min后取出,用70%、90%和100%乙醇脱水各2 min,取出,置室温下晾干,备用。
1.7.4 杂交
将变性、退火后的探针加在变性好的染色体玻片标本上,加盖片(22 cm×22 cm),用橡胶水封闭盖片四周,将玻片标本置密封的湿盒于37℃温箱中过夜。
1.7.5 杂交后洗涤
(1)准备。2×SSC 150 m L,3瓶(50 m L/染色缸);4×T(4×SSC,200 m L,Tween 20,100μL,混合后分装在4个染色缸中,每个50 m L),抗体Cy3用4×T按比例稀释(1︰1 000)。将2×SSC 3瓶,50%甲酰胺(用2×SSC配)2瓶及1瓶4×T放入水浴中预热至45℃。3瓶4×T置于室温下备用。(2)洗涤。用镊子去掉封片的橡胶,把玻片放入一瓶2×SSC中2~5 min,脱掉盖片,将玻片换到50%甲酰胺中洗2次,每次5 min,然后在2×SSC中洗2次,每次5 min,之后换到4×T中洗5 min,取出。加100μL抗体在染色体玻片标本上,用盖片或Parafilm覆盖在上面,在37℃温箱中染20 min。去掉盖片或Parafilm,在室温下于4×T液中洗3次,每次5 min。加含有DAPI的抗淬灭剂(封片液)10μL,加盖片。(3)镜检。背景染色体为蓝色(DAPI滤片观察),信号为红色Cy3(Cy3滤片观察)。
1.8 体内GFP阳性细胞检测
移植后87 d,取3只回输肝细胞的雌鼠,剪尾取血,处死并取肝和脾,放于筛网上,用注射器针蕊压碎,加适量盐水,收集滤过的细胞,溶血,上流式细胞仪检测GFP阳性细胞百分比。并取股骨,冲洗,收集骨髓细胞,溶血,上流式细胞仪检测GFP阳性细胞百分比。
1.9 统计学方法
所有数据采用SPSS 17.0软件包进行数据分析,计量资料以均数±标准差表示,各组间数据采用方差分析,检验水准为α=0.05。
2 结果
2.1 移植肝细胞后不同时间外周血检测到的GFP阳性细胞百分比
移植后18、39和53 d剪鼠尾取外周血,用氯化铵溶血,检测GFP阳性细胞百分比,移植肝细胞后18 d 3只鼠外周血GFP阳性细胞百分比平均为26.55%,移植肝细胞后39 d 3只鼠外周血GFP阳性细胞百分比平均为6.50%,移植后53 d 3只鼠外周血GFP阳性细胞百分比平为4.95%,而回输生理盐水的3只鼠外周血GFP阳性细胞百分比为0%(见图1)。
2.2 移植肝细胞后18 d外周血GFP和CD4-PE,GFP和CD8-PE双阳性百分比
移植肝细胞后18 d,外周血GFP和CD4-PE双阳性百分比为1.5%,GFP与CD8-PE双阳性百分比为0.6%,而未回输细胞的鼠双阳性为0.2%和0%(见图2)。说明移植后体内存活的肝细胞有4.7%转化为CD4+T细胞,2.8%转化为CD8+T细胞。
2.3 移植肝细胞后53 d外周血GFP和CD4-PE,GFP和CD8-PE双阳性百分比
移植肝细胞后53 d,外周血GFP和CD4-PE双阳性百分比为0.2%,GFP与CD8-PE双阳性百分比为0.2%,而未回输细胞的鼠双阳性为0%和0.1%(见图3)。说明移植后体内存活的肝细胞有3.8%转化为CD4+T细胞,4.1%转化为CD8+T细胞。移植后39 d的结果与53 d相似,故不再提供图。
2.4 移植后87 d,3只鼠体内GFP阳性细胞
移植后87 d,在3只鼠外周血、肝、脾和骨髓细胞中均检测到GFP阳性细胞,结果见图4~5。流式细胞仪检测结果表明脾细胞中GFP阳性细胞百分比最高,两两对比的结果表明脾细胞中GFP细胞阳性率相比其他细胞差异有统计学意义(P=0.003),而外周血、肝和骨髓中GFP阳性细胞百分比两两对比差异无统计学意义(P>0.05)。
2.5 移植后87d雌鼠骨髓中Y染色体阳性细胞检测
移植后87 d荧光原位杂交表明雌鼠骨髓中有2%的中期分裂相检测到Y染色体。分析100个染色体中期分裂相,有2个分裂相中检测到Y染色体(见图6)。而外周血中有1.7%的GFP阳性细胞,与骨髓中Y染色体的阳性率成正相关。
A:移植后18 d,31.7%的GFP阳性细胞中有1.5%的CD4-PE阳性细胞;B:移植后18 d,未回输细胞的鼠外周血GFP与CD4-PE双阳性百分比为0.2%;C:移植后18 d,21.7%的GFP阳性细胞中有0.6%的CD8-PE阳性细胞;D:移植后18 d,未回输细胞的鼠外周血GFP与CD8-PE双阳性百分比为0%
A:移植后53 d,5.3%的GFP阳性细胞中有0.2%的CD4-PE阳性细胞;B:移植后53 d,未回输细胞的鼠外周血GFP与CD4-PE双阳性百分比为0%;C:移植后53 d,4.9%的GFP阳性细胞中有0.2%的CD8-PE阳性细胞;D:移植后53 d,未回输细胞的鼠外周血GFP与CD8-PE双阳性百分比为0.1%
3 讨论
本研究结果表明肝细胞移植后外周血检测到GFP阳性细胞,是因为肝细胞本身含有一定量造血干细胞发挥造血重建作用,还是肝细胞回输照射鼠体内后转分化为造血干细胞需要进一步细致的研究。本研究回输肝细胞的鼠外周血检测到GFP与CD4-PE双阳性细胞,也检测到GFP与CD8-PE双阳性细胞,说明荧光鼠的肝细胞在受体鼠体内存活,并转化为CD4+和CD8+T细胞,即转化为造血细胞系标志CD4和CD8阳性细胞[7]。肝细胞回输能治疗半致死量射线照射的雌鼠,并在体内转化为造血系标志的细胞,说明了肝细胞的一个新用途,是含有造血细胞的一种细胞,或者是能在体内转分化为造血细胞的一种细胞,笔者将对肝细胞的用途有一种新的建议,课题组将继续研究肝细胞的各成分及其作用,用于造血功能被破坏的鼠的治疗,进一步建议将来将肝细胞用于再生障碍性贫血等其他血液系统疾病的治疗。
本实验制备了成年荧光鼠的肝细胞悬液,通过尾静脉回输给半致死量射线照射的C57BL雌鼠,在移植后18 d,外周血检测到GFP阳性细胞百分比较高,为26.55%,而移植后39 d和53 d GFP阳性细胞百分比趋于稳定,分别降为6.50%和4.95%,而移植后87 d检测到外周血GFP阳性细胞百分比为1.7%,骨髓中GFP阳性细胞百分比为1.4%,骨髓中Y染色体阳性率为2%,骨髓中GFP阳性细胞和Y染色体阳性细胞百分比与外周血GFP阳性细胞比较无统计学意义。所以检测造血功能重建的最简便方法就是移植后90 d左右剪鼠尾采血检测GFP阳性细胞的百分比,与昂贵的荧光原位杂交方法检测到的Y染色体阳性率呈正相关。而取外周血非常方便,只需剪鼠尾取不到50μL血,就能方便地溶血上流式细胞仪检测阳性率,而且鼠可以长期存活,连续检测,提供了一种简便鉴定造血重建的方法。
用荧光雄鼠的肝细胞回输C57BL雌鼠为回输细胞的追踪打下了良好的基础,一方面外周血检测到GFP阳性细胞,另一方面骨髓中检测到Y染色体阳性细胞,结果证实了肝细胞回输后在受体鼠内存活并发挥了造血系细胞的作用。用荧光雄鼠做移植供体,建立了一种简便鉴定造血重建的新方法,如果在外周血检测到GFP阳性细胞,就能代表重建的程度,与荧光原位杂交检测到的Y染色体百分比呈正相关,用简单便宜的方法就能取代昂贵的FISH检测,为鉴定造血重建和重建程度提供了新思路。
而移植后87 d在处死的3只鼠的肝、脾和骨髓中均检测到GFP阳性细胞,进一步证明了肝细胞回输雌鼠体内后,在雌鼠体内存活并发挥重建造血功能的作用,其中脾细胞中检测到的GFP阳性细胞百分比高于外周血、肝、骨髓中检测到的GFP阳性细胞,两两比较有统计学意义(P=0.003)。说明回输的肝细胞经过外周血循环分布于雌鼠体内各器官,而在脾脏中定植并发挥造血重建的作用。由于脾脏是造血器官,所以脾脏中存活的GFP阳性细胞最多,相比外周血、肝和骨髓细胞中存活的植入细胞有统计学意义。结果提示成年鼠的肝细胞也含一定量造血干细胞,可能没有胎鼠肝细胞含的造血干细胞多,但也在照射后的雌鼠体内存活并发挥了作用。如果成年鼠肝细胞中不含造血干细胞,则另一个推测是肝细胞回输后在雌鼠体内转分化成了造血系的细胞,具体机制有待研究。
近年来,很多用肝细胞移植治疗肝衰竭和代谢性疾病的研究,且在动物模型和人的治疗中取得了成功[8,9,10],这个方法比肝移植技术简单,没有肝移植昂贵,来自一个供者的肝细胞可用于多个患者,而且可以冷冻保存,比实体器官移植减少了免疫反应[11,12,13,14,15]。用肝细胞通过静脉输注给照射鼠,观察肝细胞在体内的分布和演变,也为肝细胞移植提供了可以借鉴的实验数据。
荧光蛋白基因论文 第5篇
关键词：杆菌肽；牛血清白蛋白；相互作用；荧光光谱；猝灭；热力学参数
中图分类号：Q631 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0245—03
杆菌肽是一种药用饲料添加剂，在畜牧养殖业应用广泛，具有促进动物生长、抑制肠道中有害微生物生长、提高机体免疫力的作用，被誉为绿色抗生素饲料添加剂。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）是血浆中含量最丰富的蛋白质之一，在血液中主要具有维持渗透压、缓冲pH值等作用。BSA可与多种阳离子、阴离子、其他小分子物质结合，具有储运内源性代谢产物、外源性药物的重要生理功能；因此，BSA与药物分子的相互作用研究已受到重视。杆菌肽被摄入机体后，极有可能与血液中的BSA结合，以复合物形式在体内吸收、转运。研究杆菌肽与BSA之间的相互作用，有助于了解药物在体内的运输分布和代谢，对于阐明杆菌肽的药理作用和药代动力学具有重要意义。荧光光谱法是研究蛋白质等生物大分子与各种小分子相互作用的重要手段。应用荧光光谱法研究杆菌肽与BSA问的相互作用，着重阐述杆菌肽与BSA的荧光猝灭机理、结合常数、热力学常数，并使用三维荧光技术研究杆菌肽对BSA高级结构的影响。
1材料与方法
1.1仪器与试剂
F97pro型熒光分光光度计（上海棱光技术有限公司），BSll0S型精密电子分析天平（德国sartorius公司），HH系列数控恒温水浴锅（金坛市科析仪器有限公司），明澈-D型超纯水机（Millipore公司）。杆菌肽（上海金穗生物科技有限公司），牛血清白蛋白（北京索莱宝科技有限公司），其他试剂均为分析纯。以0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH值7.4）为溶剂，配制0.1 mmol/L的BSA标准溶液。杆菌肽使用超纯水配成1.0 mmol/L的标准溶液。
1.2方法
准确移取一定量的杆菌肽标准溶液于10 mL具塞玻璃试管中，加入BSA标准溶液1.0 mL，于一定温度下恒温放置1 h。在激发和发射光栅狭缝均为5 nm、激发波长为280 nm时，扫描270～500 nm波长范围内BSA、BSA-杆菌肽的荧光光谱。在激发波长270～400 nm、发射波长270～400 nm范围内进行三维荧光扫描，比较溶菌酶与杆菌肽一溶菌酶体系的荧光等高线。
2结果与分析
2.1荧光猝灭光谱
BSA分子因含有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸残基而发射内源荧光，其中色氨酸的荧光强度最大。激发光为280 nm时，可认为蛋白质所呈现的荧光源自分子中的色氨酸。荧光猝灭指任何降低某样品荧光强度的过程，分子间的相互作用可导致荧光猝灭。
由图1可知，BSA溶液在波长280 nm光激发下可在333.4 nm处具有最大荧光发射峰。在BSA浓度保持恒定的情况下，BSA的内源性荧光强度随杆菌肽浓度的增加而有规律地降低，表明杆菌肽对BSA的內源荧光发生了猝灭作用。随着杆菌肽的加入，BSA的最大荧光发射峰出现红移。杆菌肽浓度为50 nmol/L时，BSA溶液体系的最大荧光发射峰由333.4 nm变化为357.8 nm，即红移了24.4 nm。一般认为，蛋白质中色氨酸残基的最大发射峰与其所处环境的极性密切相关，由发射波长的改变可判断蛋白质构象的变化。上述现象表明杆菌肽的加入使BSA构象发生了变化，色氨酸残基所处环境疏水性降低，杆菌肽与BSA分子发生了相互作用。
2.2杆菌肽对BSA的荧光猝灭机理
有机小分子对蛋白质的荧光猝灭作用主要分为动态猝灭和静态猝灭。动态猝灭主要是一种能量转移或电子转移过程，不影响蛋白质的结构和生理活性；静态猝灭主要是由于小分子和蛋白质等生物大分子发生了相互作用，可能生成不发荧光的配合物。一般认为，动态猝灭是荧光体与猝灭剂之间因相互碰撞而使荧光被猝灭的过程，温度升高可增加分子碰撞的机会，从而提高猝灭效率；静态猝灭是荧光体与猝灭剂之间形成了基态配合物，温度升高使配合物的稳定度下降，从而减小静态猝灭的程度。动态猝灭和静态猝灭均符合Stem-Volmer关系式：
以峰的位置来看，加入杆菌肽后BSA的瑞利散射峰起始位置、荧光峰位置均无显著变化。以峰的强度来看，图3-b中“铅笔”“指纹”形纹线变得稀疏，“指纹”形纹线的变化趋势尤为明显。可见，加入杆菌肽后瑞利散射峰和荧光峰的相对强度均有不同程度的降低。
BSA的空间结构由3个结构域组成，每个结构域由2个亚结构域以槽口相对的方式形成圆筒状结构，几乎所有疏水性氨基酸残基均包埋在圆筒内部而构成疏水腔。杆菌肽分子与BSA的结合部位可能均处于这种疏水腔中，由于杆菌肽与BSA发生反应生成一种新复合物，从而导致疏水微环境极性的改变，进而引起BSA构象的变化。三位荧光光谱结果验证了本试验结论，即杆菌肽与BSA发生了相互作用，荧光猝灭机制属于静态猝灭。
3结论
利用荧光光谱法研究了杆菌肽与BSA的相互作用，杆菌肽对BSA的内源荧光具有较强的猝灭作用，原因是杆菌肽与BSA分子结合形成复合物。分别测定不同温度下杆菌肽与BSA的结合常数、结合位点、热力学参数，结果表明杆菌肽对BSA的荧光猝灭机制为静态猝灭，二者的结合主要基于静电作用，约形成1个结合位点。三维荧光光谱研究表明，杆菌肽与BSA的结合导致了蛋白质分子内部疏水微环境极性的改变，进而导致BSA构象的变化。
转基因的“荧光”克隆猪 第6篇
据魏红江教授介绍, 这些小猪就是转基因克隆猪。它们的基因不全部来自父母亲, 有一个或多个基因来自其他生物体。经鉴定, 共有10头刚出生的小猪被确定为转基因克隆猪。
魏红江介绍说, 这些转基因克隆猪体内所含的Leptin蛋白基因, 又名瘦素、瘦蛋白抗肥胖因子、苗条素, 是由肥胖基因编码、脂肪细胞分泌的一种激素样蛋白质, 具有调节摄食行为、增加能量消耗、抑制脂肪合成、促进脂肪分解和降低采食量的作用。
这种转基因克隆猪在生长、繁殖、泌乳和生长性能方面发生的改变, 将可用于脂肪沉积以及人类肥胖病和糖尿病等疾病的研究。
转基因蚕能吐荧光丝 第7篇
据日本媒体报道, 给蚕植入碗水母的荧光蛋白基因, 它会突出在自然光下呈淡绿色的丝;给蚕植入珊瑚的荧光蛋白基因, 他会突出在光下呈粉红色的丝。这一技术由日本农业生物资源研究所和群马县蚕丝技术中心共同开发。
报道说, 研究人员已选育出可以投入实际生产的转基因蚕种。此外, 他们还改进了缫丝方法。以往用热水煮茧抽丝的方法会破坏荧光蛋白, 新方法是在低于60摄氏度的温度下, 添加药剂, 并用真空锅煮茧抽丝, 这种方法不会破坏荧光蛋白。
荧光蛋白基因论文 第8篇
1 材料与方法
将节旋藻Arthrospira FACHB 438于Zarrouk液体培养基中进行预培养至对数期。培养条件为23℃恒温, 光强30μmol·m-2·s-1, 12L/12D培养。藻液黑暗处理12h以达到同步化后, 分别进行持续光照处理和正常培养。每隔4小时收一次藻, 收集48小时, 共得到26个样品组, 两种实验条件下各13个。材料用上海飞捷公司RNAfast200提取试剂盒提取总RNA, 用1%的琼脂糖电泳检测质量;用微量定量仪测定浓度和纯度。取800ng消化后的总RNA加100prmol的六碱基随机引物, 按照反转录操作流程合成cDNA。根据候选内参基因序列设计引物, 使PCR扩增效率 (E) 在95%到110%之间。
q-rt-PCR在ABI 7500 Real-time PCR Systerm上进行。反应体系按照试剂说明配制。实验过程分八次荧光定量PCR反应进行, 每次检测一个基因, 每个基因的检测包括每个样品中此基因的荧光定量PCR和标准曲线的绘制。基因的标准曲线是用极大节旋藻FACHB438的基因组DNA为模板, 稀释10、102、103、104、105、106、107倍7个浓度梯度, 然后以模板稀释倍数的对数值为横轴, 平均Ct值为纵轴做标准曲线。用geNorm软件筛选内参基因时首先样品Ct值利用2-△Ct法转化成基因表达量值Q, 具体做法如下[3]:将同一基因所有样品中Ct值最小的样品Q值设为1, 同一基因其余样品的Q值用下面两式计算:Q=Edelta Ct (1) , delta Ct=min CtsampleCt (2) 。其中E为扩增效率, 可通过标准曲线斜率计算得到, 公式为:E=10-1/斜率。GeNorm程序将量值Q作为输入文件, 把某一看家基因与其他看家基因的表达量值进行两两比对, 然后将得到的比值经过对数变换, 再计算这些对数值的标准差, 并以此作为这个基因的表达稳定性M。M值越高, 说明该基因的稳定性越差;M值越低, 说明该基因的稳定性越好。
2 结果与讨论
研究发现, 使用单一内参基因比使用2个或以上数目的内参基因引起的误差高3～6.4倍。GeNorm筛选出2个以上的内参基因。在正常生长组, 平均M值最低即表达稳定性最好的两个基因为CYP和RPL13, M值分别为1.50和1.45, 16 SrRNA的M值高达1.883在光照处理组, 平均M值最低即表达稳定性最好的两个基因也为CYP和RPL13, M值分别为1.379和1.528, 16SrRNA基因的M值高达2.195。16SrRNA在光照处理组和正常生长组相比于CYP和RPL13均未表现出较好的表达稳定性, 也意味着16SrRNA并不是一个合适的内参基因。
蓝藻作为地球上最古老的物种之一, 具有重要的研究价值。目前针对蓝藻的研究主要集中在其耐盐机制、耐碱机制以及蓝藻高效的CO2利用率。其中16S rRNA被默认为在所有实验条件下的表达量都是稳定的。但本研究发现16S rRNA的稳定性都比较差。在GeNorm分析中, GAPDH、16S rRNA和Hsp基因的M值最高, 表明它们不适合作为内参;光照处理组中基于平均M值分析, 表达稳定性最高的是CYP和RPL13基因, 在正常生长组, 基于平均M值分析, 表达最稳定的基因是RPL13和CYP基因。RPL13基因良好的稳定性在真核生物部分生物的研究中已经得到证实。CYP基因是亲环素家族一员, 它在节旋藻光系统Ⅱ中起关键作用, 而且它在环境胁迫下的马铃薯中具有很好的表达稳定性。
参考文献
[1]Revilion F, et al.Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene expres-sion in human breast cancer[J].Eur JCancer, 2000, 36 (8) :1038～1042.
[2]Tricarico C, et al Quantitative real-time reverse transcription polymerasechain reaction:normalization to rRNAor single housekeeping genes is inap-propriate for human tissue biopsies[J].Analytical Biochemistry, 2002, 309 (2) :293～300.
荧光蛋白基因论文 第9篇
乳腺癌的转移是乳腺癌的致死因子之一[1]。癌症转移过程中有以下几个步骤:上皮向间质转移 (EMT) 、浸润、内渗入血管、黏附、渗出血管以及间质向上皮转移 (MET, EMT的反向过程) [2,3]。近年来, 研究EMT在癌症转移过程中作用的研究越来越多[4,5,6]。最近研究表明EMT和乳腺癌癌干细胞、乳腺癌药物抗性和处于流动状态的癌细胞有关[7,8,9]。因此, 抑制EMT是临床上治疗乳腺癌的重要途径之一。
EMT是细胞失去上皮特性获得间质细胞表型的一种生物现象。癌细胞通过EMT而获得间充质样细胞表型和侵袭性, 实现对周围组织的浸润, 参与肿瘤侵袭和转移;在远处部位, 癌细胞通过EMT最终形成与原发灶形态和结构相似的转移灶[10]。
EMT过程涉及了诸多转录因子、miRNA、细胞因子以及相关蛋白, 并已发现Slug转录因子与EMT密切相关[11]。Slug (又称为SNAI2) 是一种锌指转录因子, 为含有helix-loophelix (HLH) 结构域的转录因子家族成员, 最初在鸡胚神经嵴和来源原条的中胚层细胞中发现[12]。近年来研究显示转录因子Slug在肿瘤转移中起促进作用, 其在转移性导管乳腺癌中表达上调[13]。E-cadherin是一种重要的肿瘤转移抑制因子, 启动子E-box区含有能与Slug结合的5’-CACCTG序列, 进而下调其表达, 促进肿瘤的侵袭转移[14]。因而, 研究Slug在乳腺癌细胞中的调控规律对于进一步了解EMT具有重要的意义。
Slug和E-cadherin mRNA在人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7中均有表达, 但Slug在转移能力强的MDA-MB-231细胞中表达较高, 而E-cadherin表达较低[17]。敲除Slug基因, MDA-MB-231细胞引发肿瘤的能力降低, 且向肺转移能力降低5倍[15]。
Slug与乳腺癌干细胞有关。CD44+/CD24-是乳腺癌干细胞的细胞表面分子标志。MCF-7为CD44-/CD24+表型, Slug在MCF-7中过表达后产生CD44+/CD24+表型癌细胞, 根据微球体的形成能力, CD44+/CD24+表型是和乳腺癌干细胞相关的[16]。
另外, 特异的microRNAs (miRNAs) 包括miR-206、miR-221/222、miR-200、miR-141、miR-203、miR-130a可以调节EMT和Slug[17,18,19,20,21,22]。Elisabetta Lambertini (2012) 等人的研究显示在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中, Slug和miR-221/222启动子E-box区域结合调控其表达, 敲除Slug后, miR-221/222初级转录产物下降[23]。敲除miR-221/222后, Slug在MDA-MB-231和MDA-MB-468中的表达降低[24]。Slug也是miR-124的靶基因, miR-124结合在Slug 3’-UTR调控其表达。miR-124在乳腺癌组织中低表达, 在体外高表达miR-124抑制乳腺癌细胞系的迁移和浸润, 但是Slug过表达后, miR-124的抑制作用消失[25]。这些研究表明, Slug除了参与调控蛋白编码基因参与EMT之外, 还通过调控微小RNA参与EMT的调节。
以上研究通过Slug基因过表达、基因敲除和miRNA调控研究其在乳腺癌中的作用, 而关于其启动子的调控鲜有报道。本研究旨在明确Slug的转录调控启动子区域, 克隆其启动子区, 并鉴定其在人乳腺癌细胞系MDA-MB-231中的活性。为以后靶向调节Slug启动子活性奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
MDA-MB-231细胞系、p ECFP-N1质粒、DH5α为作者实验室保存;p MD-19T Simple Vector购自Ta KaRa公司。
1.1.2 试剂
DNA聚合酶为Transgen公司产品;限制性内切酶为Thermo Scientific公司产品;p MD-19 T Simple、T4DNA连接酶为Ta KaRa公司产品;DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自OMEGA;Lipofectamine 2000购自美国Invitrogene;胎牛血清、链霉素/青霉素抗生素、胰蛋白酶购自Hyclone公司;氨苄青霉素、卡纳青霉素购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;其余化学试剂均为国产分析纯。
1.1.3 仪器
PCR仪、凝胶成像仪 (伯乐) ;移液器、台式冷冻离心机 (Thermo Scientific) ;电子天平 (上海菁海仪器有限公司) ;磁力搅拌器 (荣华仪器制造有限公司) ;低速离心机 (中科中佳) ;稳流稳压电泳仪 (北京六一仪器厂) ;二氧化碳细胞培养箱 (Heraeus) ;超净工作台 (苏净安泰) ;低温冰箱 (中科美菱) ;-80℃低温冰箱、高压蒸汽灭菌锅 (Sanyo) ;制冰机 (Ziegra) ;恒温摇床 (国华企业) ;恒温水浴锅 (上海科析试验仪器厂) ;倒置显微镜、倒置荧光显微镜 (奥林巴斯) ;激光扫描共焦显微镜 (蔡司) 。
1.1.4 培养基
液体LB培养基 (10g/L胰蛋白胨, 5g/L酵母提取物, 5g/L氯化钠) ;固体LB培养基 (10g/L胰蛋白胨, 5g/L酵母提取物, 5g/L氯化钠, 琼脂粉15g/L) ;Hyclone RPMI-1640培养液购自Hyclone公司。
1.2 方法
1.2.1 Slug启动子引物设计
根据UCSC人Slug基因 (NM_003068) 转录起始位点上游2000碱基序列设计引物, 合成由北京鼎国公司完成。
上游序列:5’-ATTAATCACCCTCGGATACCTGCTGAT-3’;
下游序列:5’-GGAATTCCTCCTTTACGAACTGAGCCCGT-3’ (下划线序列是酶切位点) 。
1.2.2 MDA-MB-231细胞培养和基因组DNA提取
1.2.2. 1 细胞培养:
人乳腺癌MDA-MB-231细胞贴壁培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100g/ml链霉素的RP-MI-1640培养基中, 置37℃、5%CO2培养箱中常规传代, 取对数生长期细胞进行试验。
1.2.2. 2 基因组DNA提取
(1) 选择25cm2培养瓶中聚合度达到80%的MDA-MB-231细胞, 弃瓶中培养基, 用10m L 1×PBS洗2遍, 加入1m L胰酶, 在培养箱中消化5min。
(2) 细胞都消化后, 向瓶中加入5m L 1×PBS, 用移夜器吹散细胞并转移到15m L离心管中, 1 500r/min离心5min, 弃上清。
(3) 用450μL TE9.0 (0.5 mol/L Tris, 0.02 mol/L EDTA, 0.01mol/L Na Cl) 悬浮细胞。
(4) 向细胞悬液中加入100μL 10%SDS, 混合均匀, 用移液器转将细胞悬液转移至2个1.5m L离心管内。
(5) 向2个离心管中分别加入125μL 6mol/L Na Cl, 混合均匀, 2 500r/min离心30min。
(6) 将上清转移至新EP管中, 加入上清液2倍体积的无水乙醇, 混匀后, 12 000r/min离心10min, 弃上清。
(7) 室温晾干, 用50μL去离子水溶解DNA, -20℃冻存备用。
1.2.3 Slug启动子扩增
以1.2.2提取的DNA为模版PCR, PCR体系如下:
反应条件:94℃4min, (94℃30s, 60.5℃30s, 72℃2min) 35个循环, 72℃7min, 然后置于4℃保存。
1.2.4 构建p MD-19T Simple/Slug Promoter克隆载体
按照OMEGA DNA胶回收试剂盒回收Slug片段, 与p MD19-T Simple Vector连接, 按说明步骤将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 取200μL已转化的菌液、16μL IPTG和40μL X-gal混匀后涂布于含Ampicillin (50μg/μL) 的LB平板, 37℃培养箱倒置培养12~16h。从转化的平板上挑取8个白斑, 做菌落PCR (条件和体系同1.2.3) 鉴定。大量培养PCR鉴定阳性菌落, AseⅠ/EcoRⅠ酶切鉴定提取的质粒, 37℃酶切12h, 琼脂糖凝胶电泳 (10g/L) , 根据酶切结果鉴定正确克隆, 将阳性克隆菌液送华大基因公司测序。构建成功的质粒命名为p MD-19T Simple/Slug Promoter。
1.2.5 双酶切p MD-19T Simple/Slug Promoter克隆载体和p ECFP-N1载体
将测序正确的菌液重新涂板, 提取质粒, 进行AseⅠ/EcoRⅠ酶切, 获得Slug启动子, 与此同时AseⅠ/EcoRⅠ酶切p ECFP-N1载体, 切去CMV启动子, 回收线性载体大片段。
1.2.6 构建p ECFP-N1/Slug Prompter重组质粒
用AseⅠ/EcoRⅠ消化回收的Slug片段和p ECFP-N1, 16℃过夜连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 并涂布于LB固体平板上, 随机挑选10个菌落, 进行菌落PCR鉴定。
1.2.7 p ECFP-N1/Slug Promoter重组质粒测序鉴定结果
扩大培养阳性菌落, 保存菌液送华大基因公司测序。构建成功的质粒命名为p ECFP-N1/Slug Promoter。
1.2.8 重组质粒转染MDA-MB-231细胞和共聚焦显微镜检测荧光蛋白活性
将MDA-MB-231细胞培养至对数生长期, 接种于12孔板, 待细胞生长至70%~80%聚合, 瞬时转染步骤依据Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书, 转染后细胞每孔加入无血清无抗生素的新鲜培养液RPMI-1640, 于37℃、5%CO2细胞培养箱内培育培养4~6 h。吸出培养板中的培养液, 换成含有血清无抗生素的新鲜培养液, 37℃、5%CO2培养24h, 封片。
用蔡司激光扫描共聚焦显微镜 (Zeiss LSM 510 META) 观察试验结果。
2 结果与分析
2.1 MDA-MB-231基因组DNA提取
收集生长状态良好的乳腺癌MDA-MB-231细胞, 根据1.2.2.2的方法提取基因组DNA, 图1为提取结果。
2.2 Slug基因启动子扩增
图2显示在2000处有与预测片段大小相同的目的条带。
2.3 p MD-19T Simple/Slug Promoter菌落PCR以及酶切鉴定
Slug启动子PCR产物胶回收后, 与p MD-19 T Simple载体连接, 连接产物转化大肠杆菌感受态, 从转化的蓝白斑LB平板上随机挑取8个白斑, 做菌落PCR, 其中6个菌落在2 000bp处有目的条带 (图3) 。
为进一步验证Slug启动子连接到p MD-19 T Simple载体上, 将菌落PCR鉴定为阳性的菌落扩大培养, 提取质粒, 进行双酶切鉴定, 图4显示酶切结果, 和阴性对照相比, 2 000bp处有目的条带, Slug启动子与p MD-19 T Simple载体连接成功, 命名为p MD-19T Simple/Slug Promoter。
2.4 p MD-19T Simple/Slug Promoter载体和p ECFP-N1载体双酶切结果
提取连接成功的p MD-19T Simple/Slug Promote质粒和p ECFP-N1质粒, 并进行双酶切, 酶切结果如图5, 结果显示双酶切完全。
2.5 p ECFP-N1/Slug Prompter重组质粒菌落PCR鉴定结果
双酶切后回收Slug启动子和p ECFP-N1载体, 进行连接反应, 转化大肠杆菌DH5α感受态, 随机挑取10个菌落, 做PCR验证 (图6) , 和阴性对照相比, 除9号克隆外, 2 000bp处均有目的条带, 说明Slug连接到p ECFP-N1载体上。
2.6 p ECFP-N1/Slug Promoter重组质粒测序鉴定结果
p ECFP-N1/Slug Promoter重组质粒经测序与UCSC上人类Slug基因上游2000序列进行对比分析, 存在3个位点突变, 与人类Slug基因启动子序列99%同源。
2.7 荧光蛋白活性的共聚焦显微镜检测
共聚焦检测 (图7) 结果, 和阳性对照 (图7A1-A3) 相比, MDA-MB-231转染p ECFP-N1/Slug Promoter重组质粒后 (图7C1-C3) 也显示荧光, 而阴性对照无荧光 (图B1-B3) 。Slug启动子能够驱动荧光蛋白在MDA-MB-231细胞中表达 (Slug启动子不能驱动荧光蛋白报告基因在MCF-7细胞中的表达, 未发表的结果) 。
3 讨论
Slug是上皮细胞向间质细胞转化 (EMT) 的重要调控因子之一。Slug的转录激活导致细胞表现出间质细胞特征, 而Slug的转录抑制导致细胞表现出上皮细胞特征。Slug诱导的EMT主要是通过抑制上皮细胞标志因子E-cadherin的表达。其他转录因子包括锌指转录因子SNAIL、TCF8/δEF1/ZEB1、ZEFH1B/SIP1/ZEB2、碱性螺旋-环-螺旋因子E12/E47和Twist在特定的细胞类型和环境下也参与对E-cadherin的转录抑制作用。此外, Slug还能够协助其他转录因子调节EMT。Esmeralda Casas (2011) [26]等人的研究显示Slug在Twist1诱导EMT过程中发挥重要作用。Twist1通过结合在Slug启动子 (-306到-248) 上的保守E-box区域来诱导Slug转录, 敲除Slug基因完全阻止了Twist1对E-cadherin表达的抑制作用;Slug和Twist1共同作用促进EMT和肿瘤细胞转移。此外, Esmeralda Casas (2011) [26]等在该研究中还发现激活Twist1能够诱导ZEB1和ZEB2转录因子表达, 但抑制Slug阻碍了Twsit1对ZEB1和ZEB2的诱导作用。研究表明, 整合素 (intergrin) αVβ3和纤维连接蛋白 (fibronectin) 通过上调Slug促进肺癌的转移[27]。LEF1通过与间质型细胞标志物纤维连接蛋白启动子的相互作用促进细胞的EMT[28]。叉头蛋白M1 (FOXM1) 通过转录激活Slug促进乳腺癌EMT[29]。
ER配体激活信号通路和E-cadherin-snail-slug EMT信号通路是人乳腺癌中最常见的两种信号通路。在表达ER的乳腺癌细胞系MDA-MB-468中, 激活的E2 (ERα的主要配体) 使Slug表达受到抑制, E2、ERα、HDAC1和N-CoR形成的共抑制子抑制网络结合在Slug启动子 (-456到-68) 上, 抑制Slug的活性[30]。最近的研究发现人乳腺癌组织和细胞系中Elf5 (转录因子E74-like因子5, 又叫ESE-2) 经常处于缺失的状态[31,32], 意味着Elf5潜在的肿瘤抑制作用。研究表明, Elf5通过结合在Slug启动子 (-336到-285) 上抑制EMT作用[33]。除此之外, 在人Slug启动子的-879和-1846位点分别有转录抑制因子Fox A1结合位点[34]。
Fox A1是上皮细胞决定因子之一, 也是CDH1的诱导因子之一, 因此, Fox A1的缺失可能是导致EMT的因素之一[35]。T-box18 (Tbx18) 和Wilms肿瘤基因 (Wt1) 通过直接结合到Slug启动子上调或下调小鼠Slug基因的表达[36]。在原发性肝癌 (HCC) 细胞中, Sox2的表达与Slug启动子的活性相关[37]。肿瘤抑制因子Krüppel样因子4 (Krüppel-like factor4, KLF4) 能够结合到Slug启动子并抑制其活性, 其抑制活性位点在Slug启动子-300bp[38]。另外, Slug的表达除了受转录因子的调控外, 还受表观遗传学的调控, 如甲基化状态的调控[39]和微小RNA的调控[40]。在人乳腺癌原位肿瘤和非转移细胞系中, miR-203高表达, 而在转移性细胞系中低表达。Zhiqian Zhang (2009) 等人研究发现miR-203结合在SNAIL2/Slug 3’-UTR抑制其表达;MDA-MB-231细胞转染pc DNA-pri-miR-203质粒后, Slug mRNA和蛋白质水平均明显下降[40]。该研究提示除了启动子外, 可以通过Slug 3’-UTR调控其表达。
综上所述, 可见Slug启动子上既含有转录激活位点也含有转录抑制位点。因而, Slug在EMT中的作用是取决于其所存在的细胞环境。本研究克隆的Slug启动子为2 000bp。以该启动子驱动的荧光蛋白报告基因活性检测结果表明, 该启动子在上皮细胞型乳腺癌MCF-7中完全没有活性, 而在间质型乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞中具有活性, 说明该启动子既含有上皮细胞中的转录抑制因子结合位点又含有间质细胞中转录激活因子结合位点。本研究所采用的荧光蛋白报告基因方法相对于常规的荧光素酶报告基因方法简便、结果直观, 且能结合细胞分选技术开展进一步研究。基于该研究结果, 根据转录因子预测结果进行的各种Slug启动子突变体构建正在进行中, 后续的研究将获得一些新的Slug激活因子和抑制因子。
4 结论
荧光蛋白基因论文 第10篇
关键词：姜黄素,胶原蛋白,硝酸亚铈,荧光猝灭
1 引言
胶原蛋白是机体内多种组织的主要组成成分,并行使十分重要的功能,因其生物可降解性、生物相容性和安全无毒及良好的可加工性能等,外源性胶原蛋白基生物材料在组织创伤后的止血、修复、缺损性充填、药物释放等生物医学方面孕育着巨大的发展潜力[1,2]。姜黄素,主要来源于姜科姜黄属植物姜黄的根茎,是姜黄中的主要活性成分。姜黄根茎中姜黄素含量约为2%～5%[3]。现已证明姜黄素具有抗氧化、抗炎、利胆、抗肿瘤、降压、降血脂、抑制血小板聚集、增强纤维活性和抗动脉粥样硬化等药理作用[4,5]。稀土在药物化学领域,也有较好的应用成果,稀土有机配合物具有抗炎、抗菌、抗凝血、抗癌等作用,可用于治疗烧伤、血栓病、皮肤病、糖尿病以及关节炎、结核、风湿病、艾滋病等等[6]。目前,姜黄素与胶原蛋白及含稀土的胶原蛋白(胶原蛋白与稀土已配位)之间作用的性质未见报道。而研究姜黄素与胶原蛋白及含稀土的胶原蛋白之间的作用性质对于开发胶原蛋白基生物材料在组织创伤后修复及药物释放等方面的研究有一定参考意义。本文通过荧光光谱法研究姜黄素与胶原蛋白的作用,并进一步研究了姜黄素与含硝酸亚铈的胶原蛋白之间作用的性质,及其荧光猝灭作用机制,并计算了其结合常数、结合位点及其作用力。
2 实验部分
2.1 实验设备与药品
2.1.1 实验设备
荧光分光光度计,美国Cary Eclipse(瓦里安);电子分析天平TG328A,上海分析仪器厂。
2.1.2 药品
姜黄素(AR),成都科龙化工试剂厂;硝酸亚铈(AR),成都科龙化工试剂厂;无水乙醇(AR),成都科龙化工试剂厂;胶原蛋白(相对分子质量2000～4000Da),铭让公司。
2.2 光谱性质实验
温度为30℃、35℃、40℃的条件下按下列步骤对姜黄素与胶原蛋白及含硝酸亚铈的胶原蛋白的荧光强度进行测定。
(1)取2.4 m L0.1%的胶原蛋白溶液于石英比色皿中,用微量注射器依次加入不同浓度的姜黄素分别作用5 min后,测定荧光强度变化。发射波长290～350 nm,发射光缝隙5 nm,激发光缝隙10 nm。
(2)取2.4 L含有0.02%硝酸亚铈的0.08%胶原蛋白溶液于石英比色皿中,用微量注射器依次加入不同浓度的姜黄素作用5min后,测定荧光强度变化。发射波长290～420 nm,发射光缝隙5nm,激发光缝隙5 nm。
3 实验结果分析
3.1 姜黄素与胶原蛋白的相互作用
由图1和图2作用结果可以看出,随着姜黄素浓度的增加,胶原蛋白和含硝酸亚铈的胶原蛋白的内源荧光强度有规律地降低,且发射峰峰位及峰型不变,说明它们之间有结合作用。
3.2 姜黄素对胶原蛋白及含硝酸亚铈的胶原蛋白荧光猝灭机理
荧光分析法由于具有灵敏度高,选择性强,用样量少,方法简便以及能提供较多的物理参数等特点,因而广泛用于生物大分子的构象及机理研究中。组成蛋白质的基本氨基酸通常只有20种,其中只有含苯环的氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)才是荧光物质,其相对荧光强度比为100∶9∶0.5[7]。在构成胶原蛋白质的l8种氨基酸中,由于不存在色氨酸,而苯丙氨酸在绝大多数实验条件下不被激发,所以很少能观察到苯丙氨酸的发射,这样蛋白质的内源荧光主要来自酪氨酸的贡献[8,9]。蛋白质的荧光及其变化直接反映了蛋白质中酪氨酸残基本身和周围环境的变化。随着体系中姜黄素浓度的逐渐增加,胶原蛋白、含硝酸亚铈的胶原蛋白的内源荧光产生有规律的猝灭。荧光猝灭作用因猝灭机制的不同可分为动态猝灭、静态猝灭和非辐射能量转移猝灭作用等,动态猝灭作用可用Stem-Volmer方程(1)进行描述,静态猝灭可用方程lineweaVer-Burk方程(2)描述:
式中,Fo为无猝灭剂时的荧光强度,F为有猝灭剂时的荧光强度,[Q]为猝灭剂浓度,Ksv为动态猝灭常数,它反映了生物大分子与荧光猝灭剂分子之间彼此扩散和相互碰撞到达动态平衡时的量效关系;Kq为动态荧光猝灭速率常数,它反映了体系中分子之间彼此扩散和相互碰撞对生物大分子荧光寿命衰减速率的影响。各类荧光猝灭剂对生物大分子的最大动态荧光猝灭速率常数约为2.0×1010L·mol-1s-1,τo为猝灭剂不存在时荧光分子的平均寿命。生物大分子的荧光平均寿命约为10-8s,Ka为静态猝灭常数。
实验测定了30℃、35℃和40℃下姜黄素分别与胶原蛋白、含硝酸亚铈的胶原蛋白作用的荧光猝灭光谱。以Fo/F对相应的[Q]×10-5作Stem-Volmer曲线,分别为图3、图4,从中得到不同温度下的Ksv和Kq并列于表1及表2中。
由图3可以看出,Stem-Volmer曲线呈现良好的线性关系,且随着温度升高曲线斜率逐渐降低,这表明姜黄素对胶原蛋白荧光猝灭效应归于静态猝灭机制。表1、表2显示的双分子猝灭常数Ksv远大于最大动态荧光猝灭常数2.0×1010L·mol-1·s-1,表明姜黄素对胶原蛋白、含硝酸亚铈的胶原蛋白的荧光猝灭是静态猝灭。以(Fo-F)-1对[Q]-1拟合lineweaVer-Burk方程,不同温度下姜黄素与胶原蛋白的线性相关系数R依次为0.9980、0.9995和0.9945,与含硝酸亚铈的胶原蛋白的线性相关系数R依次为0.9985、0.9995和0.9985,可见其双倒数呈现良好的线性关系,再次确定为静态猝灭。因此,可以推断,姜黄素对胶原蛋白、含硝酸亚铈的胶原蛋白的荧光猝灭并不是由于分子扩散和动态碰撞引起的动态猝灭,而是由于形成以非共价键结合的某种不发光的复合物引起的静态猝灭[10]。
3.3 姜黄素与胶原蛋白、含硝酸亚铈的胶原蛋白结合位点数及表观结合常数
在静态猝灭作用中,假设生物大分子有n个相同且独立的结合位置,荧光强度与猝灭剂的关系可由荧光物质与猝灭剂间的结合表达式(3)[11]求出:
分别作不同温度下lg[(Fo-F)/F]-lg[Q]的双对数拟合(见图5与图6)获得不同温度下的结合位点数n及表观结合常数KA(见表3和表4)。结果显示:不同温度下姜黄素与胶原蛋白的结合位点均近似为1,与含硝酸亚铈的胶原蛋白的结合位点也均近似为1。
3.4 荧光猝灭过程中热力学函数的变化与作用力的判断
猝灭体和生物大分子的结合力的类型是不同的。从热力学观点看,在一定的温度和压力下,猝灭体和生物大分子的结合反应能否自发进行,取决于体系的△G,△G<0有利于反应的自发进行。Ross等[12]根据大量的实验结果,总结出来判断生物大分子与小分子结合力性质和生物大分子自身结合力性质的热力学规律:根据反应前后热力学焓变△H和熵变△S的相对大小,可以判断猝灭体和生物大分子的相互作用力主要有氧键、范德华力、静电引力和疏水力。当△H>0,△S>0时,猝灭体和生物大分子的相互作用力为疏水作用力;当△H<0,△S<0时,猝灭体和生物大分子的相互作用力为氢键和范德华力;当△H<0,△S>0时,猝灭体和生物大分子的相互作用力为静电引力[13]。当温度相差不大时,可以把反应焓变△H看成一个常数,由Lineweaver-Burk方程中不同温度下的结合常数KA,可根据下列方程计算反应焓变△H、自由能和熵变△S。
根据以上热力学公式可得到姜黄素与胶原蛋白、含硝酸亚铈的胶原蛋白结合的热力学函数值,结果分别列于表5、表6。
由表5可知,△G<0,说明反应过程中是自发的。并且△H<0,熵变△S>0,姜黄素与胶原蛋白之间的作用力主要是表现为静电引力。这可能是在作用体系中,因为胶原蛋白中有解离的-NH3+可与姜黄素显负电性极性基团如酚羟基(或部份解离的酚羟基)、羰基、和甲氧基有较强的静电作用。
由表6可知,△G<0,说明反应过程中是自发的。并且△H>0,熵变△S>0,姜黄素与含硝酸铈胶原蛋白之间的作用力主要表现为疏水作用力。这是因为在胶原蛋白中加入硝酸亚铈后,胶原蛋白中的氨基和羧基可被硝酸亚铈络合,使得分子刚性增强,再与姜黄素作用主要表现为分子间的疏水作用力。
4 结论
(1)利用荧光光谱法,研究了姜黄素与胶原蛋白、含硝酸亚铈的胶原蛋白之间的相互作用。实验证明,不同温度下,姜黄素与胶原蛋白的作用力主要表现为静电引力;姜黄素与含硝酸亚铈的胶原蛋白之间的作用力主要表现为疏水作用力。
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